Zdravotnické noviny

Zásadní objevy v oblasti molekulární biologie vedly během několika posledních let k překvapivému zjištění – nejen nemoci dědičné, ale také celá řada nemocí získaných je často genetického původu. Současná medicína nabízí mnoho způsobů léčby, které ale neřeší samotnou podstatu choroby a pacient je na této léčbě často závislý po celý život. Alternativní postup by mohla představovat genová terapie, která vychází z předpokladu možnosti léčby onemocnění přímo v místě vzniku defektu, tedy cíleným zásahem na molekulární úrovni.

Základní koncept genové terapie coby moderní terapeutické techniky byl položen koncem 70. let minulého století, avšak prudkého rozvoje se toto odvětví dočkalo až o dvacet let později. Značný nárůst počtu publikovaných prací a patentů v oblasti genové terapie v posledních desetiletích je spojen zejména s kompletním zmapováním lidského genomu, na které navazují významné pokroky v proteomice a farmakogenomice. Navzdory rychle rostoucímu poznání funkcí jednotlivých genů a poodhalení příčiny řady geneticky podmíněných chorob je použití genové terapie v klinické praxi stále limitováno řadou technologických, ekonomických i etických problémů.

Doprava genů in vivo
Uvažujeme-li o možnosti použití genové terapie při léčbě určitého typu onemocnění, potřebujeme identifikovat poškozený gen, určit jeho přesnou lokaci v organismu a především znát mechanismus patologického účinku produkovaného proteinu. Na základě těchto znalostí je důležité zvolit správnou strategii léčby vedoucí ke zničení, náhradě nebo nápravě poškozeného genu. Jelikož je použití molekulární DNA coby nositele genové informace značně limitováno její rychlou degradací v krevním řečišti i intracelulárním prostředí a nízkou buněčnou specifičností, lze tento přístup využít pouze při lokální aplikaci přímo v postiženém místě, což bývá v praxi často dost komplikované. Pro zvýšení účinnosti transportu DNA do cílových buněk byly vyvinuty metody využívající fyzikálně-mechanických principů (elektroporace, mikroinjekce, fotochemické internalizace aj.), nicméně je nutné poznamenat, že v současné době je většina těchto experimentálních technik v raném stadiu vývoje a jsou vhodné spíše pro ex vivo a in vitro aplikace. Abychom se vyhnuli potížím spjatým s použitím nativní DNA, byly pro transport genů v živém organismu vyvinuty sofistikované nosiče, tzv. vektory. K zajištění účinného a bezpečného transportu genů do cílové buňky či tkáně v in vivo podmínkách je zapotřebí, aby vektory spolehlivě chránily DNA před degradací během transportu, odolávaly nespecifickým interakcím s buňkami imunitního systému a proteiny krevní plazmy, zabránily akumulaci v játrech, selektivně rozpoznaly poškozenou tkáň a uvolnily DNA v jádře cílových buněk. V současné době rozlišujeme dva základní typy vektorů genů, které více či méně splňují uvedená kritéria, a to virového a nevirového původu.

Virové vektory jsou zatím nejrozšířenější
Nejúčinnějšími vektory z hlediska transfekce, tedy schopnosti infikovat hostitelskou buňku, jsou viry, které během evolučního vývoje získaly schopnosti efektivně „překonat“ imunitní systém hostitele a zajistit vysokou expresi přenášených genů. Viry jsou částice malých rozměrů (20 až 400 nm) sestávající z jedné nebo více molekul nukleové kyseliny téhož druhu (DNA nebo RNA) a proteinů, které kolem nukleové kyseliny tvoří obal, tzv. nukleokapsid. Příprava virů pro účely genové terapie spočívá v odstranění části virového genomu – s výjimkou sekvencí nutných pro integraci do chromozomu, úseků definujících počátek a konec genomu a úseků kontrolujících expresi genů –, která je následně nahrazena terapeuticky využitelnými geny. Tyto viry obvykle nejsou schopné replikace. Viry mohou infikovat jen ty buňky, které na svém povrchu mají receptory k některému z proteinů virového nukleokapsidu. Nevýhodou virových vektorů je jejich relativně vysoká imunogenicita a především schopnost infikovat široké spektrum buněk, což do jisté míry omezuje jejich přímou aplikaci v klinické praxi. Nejčastěji používanými virovými vektory jsou adenoviry, retroviry, poxviry aj.

Polyplexy a lipoplexy příslibem pro budoucnost
Zatímco viry představují doposud mnohem účinnější systémy z hlediska přenosu genů a mezi klinicky testovanými vektory zaujímají dominantní postavení, je značné úsilí věnováno také vývoji nevirových vektorů. Ty by díky svým příznivým vlastnostem, jako jsou zanedbatelná imunogenicita, nízká akutní toxicita a možnost relativně snadné přípravy ve velkém množství, mohly představovat vhodnou alternativu vektorům virového původu. Hlavními zástupci této skupiny vektorů jsou komplexy DNA s kladně nabitými polymery (tzv. polyplexy) nebo komplexy DNA s kladně nabitými lipidy (tzv. lipoplexy).
Nejrozšířenějším typem nevirových vektorů jsou polyelektrolytové komplexy kladně nabitých hydrofilních polymerů (polykationtů) se záporně nabitými molekulami DNA, označované jako polyplexy. Tyto částice o velikosti 40 až 200 nm je možné připravit smísením vodných roztoků opačně nabitých makromolekul. Rozměry, fyzikálně-chemickou stabilitu či míru buněčné transfekce polyplexů lze účelově měnit jak volbou a designem použitého polykationtu, tak poměrem nábojů jednotlivých polyelektrolytů nebo iontovou silou prostředí, ve kterém jsou polyplexy formovány. Průnik těchto nosičů dovnitř buněk je umožněn díky nespecifické interakci kladně nabitého povrchu komplexů (připravených s nadbytkem polykationtu) se záporně nabitou lipidovou dvojvrstvou buněčné membrány. Mezi nejčastěji studované polykationty patří poly(L-lysin), poly(ethylenimin), polymethakryláty, poly(amidoamin)ové dendrimery aj. Jelikož jsou syntetické polykationty převážně toxickými sloučeninami, které se díky svému kladnému náboji podílejí na řadě nespecifických interakcí se záporně nabitými komponentami biologického systému, bylo v poslední době věnováno značné úsilí také vývoji méně toxických biodegradovatelných polykationtů. Struktury těchto polykationtů byly navrženy tak, aby byly stabilní v krevním řečišti, ale podléhaly degradaci uvnitř buněk, čímž by docházelo k postupnému snižování koncentrace kladného náboje na polymerním řetězci, uvolnění DNA z komplexu a následně odstranění všech kladných nábojů z polymeru odpovědných za jeho nespecifické interakce a toxicitu.
Dalším typem hojně studovaných nosičů DNA patřících do skupiny nevirových vektorů jsou komplexy DNA a kationtových lipidů. Kationtové lipidy jsou amfifilní molekuly složené z kladně nabité hydrofilní „hlavy“ obsahující obvykle jednu nebo více aminoskupin, hydrofobní části tvořené lipidovým řetězcem či molekulou cholesterolu a spojovací vazby ovlivňující jejich chemickou stabilitu a biodegradabilitu. Ve vodných roztocích tvoří tyto molekuly duté částice, tzv. liposomy, tvořené lipidovou dvojvrstvou s kladným nábojem vně i uvnitř částic. Kladně nabité aminoskupiny těchto lipidů jsou schopny kondenzovat DNA do malých sférických částic, tzv. lipoplexů, a chránit DNA před enzymatickou degradací během transportu. Rovněž lipoplexy připravené v nadbytku kationtového lipidu jsou schopny pronikat dovnitř buněk díky nespecifické interakci se záporně nabitým povrchem buněčných membrán. Nevýhodou lipoplexů je jejich poměrně nízká stabilita v přítomnosti sérových proteinů, a tudíž rychlé odstranění z krevního řečiště.

Povrchová stabilizace vektorů DNA
Přestože se některé vektory jeví jako velmi efektivní systémy pro přenos genů in vitro, nejsou tyto poznatky často v souladu s výsledky získanými v reálném biologickém systému. Jejich nízká účinnost in vivo je přičítána především značným odlišnostem v biologických funkcích mezi buněčnými kulturami a složitými živočišnými modely, ale také podstatnými změnami ve složení vektorů, ke kterým dochází bezprostředně po jejich interakci s buňkami imunitního systému nebo komponentami krve. Kladný povrchový náboj komplexů vyvolává v živočišných modelech řadu nespecifických interakcí se záporně nabitými karboxylovými skupinami proteinů krevní plazmy, cévního endotelu a krvinek, což vede k významnému snížení doby cirkulace v krevním oběhu. Tato skutečnost významným způsobem omezuje jejich použití v klinické praxi. V oddělení biolékařských polymerů Ústavu makromolekulární chemie AV ČR se zabýváme nejen vývojem polyplexů, ale především povrchovou modifikací syntetických i virových vektorů hydrofilními polymery na bázi poly(ethylenglykolu) nebo kopolymery N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu. Ty dokážou nejen efektivně odstínit kladný povrchový náboj polyplexů a nespecifické receptory virů pro celou řadu buněk zdravých částí organismu, ale také zajistit vektorům vyšší stabilitu v in vivo prostředí, což se projeví významným nárůstem doby jejich cirkulace v krevním řečišti. Další nespornou výhodou povrchové stabilizace DNA vektorů syntetickými polymery je možnost zabudování směrujících jednotek přímo do struktury modifikujícího polymeru a „nasměrovat“ nebo „přesměrovat“ vektor k receptorům exprimovaným na površích cílových buněk.
Hydrofilní obal poskytuje vektorům na jedné straně spolehlivou ochranu během transportu, ale na straně druhé brání uvolnění DNA v intracelulárním prostředí. V současné době proto věnujeme značnou pozornost vývoji bioresponzivních polymerních systémů, které poskytují vektorům stabilní ochranu v krevním řečišti během transportu, ale podléhají degradaci v intracelulárním prostředí. Tyto polymery mají ve svých strukturách zabudované degradovatelné vazby reagující při přechodu z extracelulárního do intracelulárního prostoru na změny pH (hydrolyticky štěpitelné), reduktivní prostředí (reduktivně štěpitelné) nebo koncentrace enzymů (enzymaticky štěpitelné) v cílových buňkách. Tímto způsobem se může vektor po průniku do buňky zbavit stabilizujícího polymerního obalu, čímž značně usnadní intracelulární uvolnění dopravovaného genu.

Naděje pro pacienty s dědičnými a onkologickými chorobami
Rozvoj genové terapie kromě nových možností léčby řady závažných onemocnění otevírá také nové otázky související s vlastní produkcí, aplikací, ale především přepravou genů v lidském organismu. Rychle se zvyšující počet virových i nevirových systémů vstupujících do jednotlivých fází klinického testování je dokladem toho, že v budoucnosti by mohla genová terapie, společně s dosud používanými přístupy (chemoterapií, radioterapií a imunoterapií), představovat komplexní možnost léčby dědičných i většiny typů nádorových onemocnění. Je potěšitelné, že se na tomto vývoji podílí významnou měrou i česká věda.

Ing. Richard Laga, RNDr. Tomáš Etrych, Ph.D., prof. Ing. Karel Ulbrich, DrSc., Ústav makromolekulární chemie, v. v. i., Akademie věd České republiky